В Псковских писцовых книгах 1585-1587 годов впервые упомянута церковь Рождества Богородицы на ламех, т.е. на том месте, где велась добыча (ломка) известняка для строительства крепостных стен. Изначально церковь принадлежала небольшому девичьему Рождественскому монастырю. Основателем монастыря был преподобный Серапион Изборский. Единственное упоминание о нем гласит: «Серапион, начальник монастыря Рождества Богородицы, иже на ламех в Изборском уезде». Дата упразднения монастыря неизвестна. Мощи святого почивают под спудом в храме. Существующая церковь построена в конце XYII века, кем и по какому случаю - неизвестно. Церковь каменная. В архивных документах конца XYIII века упоминается придел во имя Покрова Пресвятой Богородицы. Придел был построен с южной стороны. В память о том, что под приделом оказалась часть могил, в его стены вделаны каменные кресты. Престолов в церкви два, главный - во имя Рождества Пресвятой Богородицы, придельный - во имя Покрова Пресвятой Богородицы. В 1838-1839 годах в притворе церкви пробито окно и устроен иконостас. Семь икон для иконостаса написал иконописец, псковский мещанин Петр Иванович Безродный. При церкви был хор певчих из прихожан и учеников церковно-приходских школ.

На каменной звоннице было четыре колокола. Самый большой колокол приобретен на средства прихожан в 1904 году, повешен на звоннице в 1905 году. Весом колокол 17 п. 7 ф. Второй колокол лит в 1853 году, весом 10 п.7 ф., остальные два колокола не имели обозначения веса и надписей. Согласно описи имущества церкви за 1946 год, ранее на звоннице висел колокол, на котором стояла дата 7083 год (1575 г.). По преданию, колокол велел лить царь Иоанн Грозный, возвращаясь в Москву из Печерского монастыря.

Вокруг церкви ранее было небольшое кладбище, здесь похоронены некоторые изборские священнослужители.

В приходе было 7 часовен, в том числе шесть деревянных. Каменная часовня во имя Святой Преподобномученицы Анастасии была построена на собственные средства жителями деревни Шахницы вместо сгоревшей в 1874 году деревянной часовни. Деревянные часовни находились в деревнях: Замогилье - во имя Святого преподобного Никандра пустынножителя Псковского Чудотворца, Кряково - во имя Пресвятой Троицы, Бобьяково - во имя Святой великомученицы Параскевы, Куланово - во имя Святого архистратига Михаила, Шахницы - во имя Святых Первоверховных апостолов Петра и Павла, и часовня в деревне Великополье.

Первая церковно-приходская школа в Изборске была открыта 3 октября 1883 года, находилась в церковном доме. Школа устроена стараниями настоятеля храма с 1870 года о. Павла Ивановича Щекина, окончившего духовную семинарию и ранее имевшего учительскую практику. Учителем в ней трудился дьякон-псаломщик Иоанн Петрович Сырохнов, помощником учителя по школе - жена священника Елизавета Ефимовна Щекина, окончившая училище Святой Елены в Петербурге. Вскоре для школы был приобретен дом, школа содержалась на церковные средства, отопление и освещение обеспечивали прихожане. Здание школы было одним из благоустроенных в уезде. Протоиерей Павел Николаевич Щекин много заботился о развитии школьного дела в Изборске, в благочинническом округе, где был 24 года благочинным. Его заслуги в деле народного образования и воспитания отмечены духовным начальством, он был награжден орденом святой Анны 3-й степени. П.Н. Щекин скончался 18 октября 1906 года и похоронен рядом с храмом. В 1885 году в школе обучались 53 ученика, в 1900 году - 92, в 1907 году - 106, в 1910 году - 85 учеников, в 1913 году - 83 ученика обоего пола. С 1905 по 1930 год заведующим школой и законоучителем в ней был протоиерей Капитон Матвеевич Любомирский. По закону о сокращении штатов 14 апреля 1930 года он уволен от заведования школой, и важное дело перешло к людям неопытным и неумелым.

Еще одна церковно-приходская школа была открыта в деревне Мылово в 1900 году. Вначале это была школа грамоты, помещалась в наёмной крестьянской избе. В 1903 году в ней обучались 43 ученика. После 1905 года она переведена в разряд церковно-приходских школ, в 1907 году в ней учились 60 учеников, в 1913 году - 40 учеников.

В 1904 году учреждена земская школа в деревне Бобьяково. Она переведена сюда из деревни Боровики прихода собора Николая Чудотворца. В 1907 году в ней обучались 73 ученика. В 1910 году открыты земские школы в деревнях Поддубье и Авдоши.

В 1900 году в приходе было 3965 прихожан обоего пола.

В соответствии с Тартуским договором 1920 года Изборск входил в состав Эстонской Республики. В 1920-1934 годах священником был протоиерей Иоанн Коведяев, в 1936-1943 годах - Иоанн Панов; должность псаломщика исполнял Иван Минин (1930-1936); регентом церковного хора с 1923 по 1938 год был Б.П. Жемчужин; церковными старостами были Илья Михайлов (1920 г.), Алексей Барканов (1928 г.), Г.И. Жуков (1930-1934 гг.), Василий Алексеевич Спичеков из деревни Слизово (1934-1945 гг.).

В 1931 году состоялись торги на право ремонта Богородицкой и Никольской с Городища церквей. По результатам торгов право ремонта получил имевший свидетельство «на право мастера» Михаил Дондуков (город Печоры). Ремонт был завершен в 1936 году.

В годы Великой Отечественной войны снарядом повреждена апсида.

В 1944 году Изборск возвращен в состав Российской Федерации, включен в состав Псковской области.

Храм не закрывался, он является действующим и в наши дни. В 1944-1950 годах священником Рождественской и Николаевской с Городища церквей был Иван Дмитриевич Панов. Псаломщиком в 1947 году был Василий Алексеевич Спичеков. В 80-х годах ХХ века здесь служил известный псковский старец Валентин Мордасов, в 90-х годах здесь служил архимандрит Никодим Миронов, бывший до этого духовником Вильнюсского монастыря Святого Духа. Колокол времен царя Иоанна Грозного находится в музее. Под склоном храма находится Богородичный источник, по преданию, освященный самим преподобным Серапионом. Святая вода источника дает исцеление и в наши дни. Сохранилась Троицкая часовня в деревне Кряково. С 1997 года, возрождая традиции духовного просвещения, при храме действует православный лагерь для детей из разных городов России. У многих детей именно здесь происходит первая встреча с Богом.